La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética que afecta a niños y adultos en todo el mundo. A pesar de su relativa baja incidencia, la frecuencia de portadores no afectos es muy elevada y el gran número de variantes conocidas hace que la terapia personalizada suponga un auténtico reto.

Esta complejidad se manifiesta también en la penetrancia incompleta de algunas variantes, por lo que podrían existir un gran número de mutaciones todavía por descubrir.

En este artículo os voy a contar desde lo más básico, como es el mecanismo molecular y celular por el que se produce, su tratamiento, hasta los métodos de diagnóstico y screening, junto con el reto que se plantea para ambos.

Conceptos básicos de la fibrosis quística

La fibrosis quística es una enfermedad autosómica recesiva que afecta a más de 70.000 personas en todo el mundo, fundamentalmente a los de origen europeo, con una frecuencia pan-étnica media de 1/3500 nacimientos. Hace más de 30 años que se descubrió la primera mutación causante en el gen CFTR. Esta mutación (F508del) ha pasado a ser la más conocida y frecuente en población general.

El descubrimiento de ésta y otras más de 2.000 variantes del gen ha desencadenado, como no podía ser de otro modo, el diagnóstico y screening de portadores, la correlación de variantes con características clínicas específicas, así como el descubrimiento de que ciertas variantes de CFTR producen otras enfermedades. Os recomiendo leer el siguiente review de Cutting et al.

De hecho, CFTR es el gen más analizado a nivel mundial en la búsqueda de portadores, junto con el FMR1 (X-frágil y asociados) y SMN1 (Atrofia muscular espinal).

La enfermedad se manifiesta ya al poco de nacer (2/3 de los pacientes son ya diagnosticados en el primer año de vida) con síntomas característicos como son la presencia de secreción viscosa y la acumulación de la misma en vías aéreas y en conductos pancreáticos, lo que lleva al daño irreversible de todos ellos. La absorción de nutrientes se ve también comprometida, llevando a una malnutrición y defectos de crecimiento.

La esperanza de vida de los niños con fibrosis quística que no son tratados es, como máximo, de 10 años. Sin embargo, se puede alcanzar la edad adulta (hasta 40 años) con los tratamientos adecuados.

Mecanismos moleculares de la fibrosis quística

La proteína CFTR es un transportador de iones cloruro que se encuentra en la membrana apical de células epiteliales. Su función es la de exportar iones cloruro, lo que se consigue mediante un mecanismo dependiente de ATP y cuya activación requiere así mismo de fosforilación dependiente de cAMP (regulación).

Este canal de iones tiene dos dominios transmembrana que forman el canal o poro, 2 dominios intracelulares ABC (de unión a ATP) y un sitio regulador que es sometido a forforilaciones por protein kinasas (véase la Figura 2). Se han descrito mutaciones con cambio de aminoácido en toda su longitud (40% de las conocidas). Sin embargo, también las hay que alteran el procesado de ARN (36%), que producen grandes reordenamientos (3%), e incluso existen algunas donde no se tiene claro lo que hacen.

Si el canal no funciona bien (actividad) o ni siquiera está en membrana (cantidad), el transporte de iones Cl se ve afectado, así como el agua o los iones bicarbonato. Esto es lo que produce ese moco espeso que bloquea todo tipo de conductos fisiológicos.

Canal de iones cloruro en membrana de células normales y en células de pacientes con fibrosis quística
Figura 1. Canal de iones cloruro en membrana de células normales (izquierda) y en células de pacientes con fibrosis quística (derecha).

Se ha intentado tradicionalmente clasificar a cada variante (mutaciones) en cinco o seis clases dependiendo del proceso afectado desde su síntesis hasta su actividad ya en membrana, pero sin éxito, dado que hay variantes que afectan concomitantemente a varios de ellos.

Claro ejemplo de esto es la archiconocida F508del. Esta mutación lleva al pliegue 3D incorrecto de la proteína, lo que lleva a la degradación de la mayor parte, y el resto que queda sin degradar va a membrana pero ya no es efectivo. Más aún, incluso el aa anterior (Ile) a pesar de no cambiar en sí, cambia su codón a uno de muy bajo uso, por lo que la eficiencia de traducción se ve afectada. Todo esto daría 3 o más clases diferentes y es un ejemplo de que esa clasificación es confusa, cuanto menos.

Se muestra todo el proceso que somete CFTR desde su transcripción a su inserción de membrana, además de los dominios funcionales.
Figura 2. Se muestra todo el proceso que somete CFTR desde su transcripción a su inserción de membrana, además de los dominios funcionales.

Modelos celulares y animales

Esta es una sección que intento no dejar de lado jamás en mis artículos. Por un lado, se han usado células epiteliales primarias con problemas de vida media corta y regulatorios, y además, es muy invasivo. También se usan células madre embrionarias o de intestino que se reprograman a células epiteliales secretoras para estudiar el transporte de ion cloruro y efecto de pequeñas moléculas que luego podrían ser tratamientos. Aquí se ha jugado mucho con CRISPR-Cas9 para recrear mutaciones.

Por otro lado, es de las pocas enfermedades que conozco que disponga de hasta 5 modelos animales: ratón, rata, hurón, cerdo y pez cebra. Es obvia la profundidad de conocimiento a nivel de órgano que ofrecen, pero no han conseguido replicar bien la enfermedad. Y aún con todo, han sido esenciales. Por ejemplo, el modelo de ratón no desarrollaba enfermedad pulmonar en nacimiento, y esto llevó a investigar otros transportadores de cloruro y como potenciarlos en humano. En el caso del hurón y el cerdo, la arquitectura pulmonar es más conservada con humano, y el cerdo desarrolla antes la enfermedad, lo que permite ir al génesis de la enfermedad y descubrir que hay una respuesta inflamatoria anterior a cualquier tipo de infección bacteriana.

Estos modelos han ayudado a derrumbar tres mitos sobre la enfermedad: no hay un mal transporte de iones sodio, la obstrucción intestinal en neonatos se produce por proteína CFTR incorrecta en intestino, no por disfunción exocrina del páncreas, y por último, la diabetes que aparece ya en paciente adulto no es causada por daño exocrino en páncreas, que afecta y destruye el páncreas endocrino, sino producida por un defecto previo e intrínseco del sistema endocrino.

Moduladores genéticos de la gravedad

Los genotipos de CFTR correlacionan bien con el fenotipo de páncreas exocrino y niveles de cloruro en sudoración pero no tanto con la función pulmonar. Se han hecho estudios con gemelos mono y dicigóticos afectados con fibrosis quística y se han estudiado la influencia de factores genéticos y factores ambientales con un resultado sorprendente: un 50% de las diferencias entre ellos podía ser asignada a modificadores genéticos.

Hasta 50 moduladores han sido identificados, entre ellos, el TGFb-1. Este factor está relacionado con reparación de tejido y fabricación de matriz extracelular. Algunas variantes están relacionadas con riesgo de asma y EPOC, otras con menor daño pulmonar, siempre en variantes no F508del.

Otros modificadores influyen en una supervivencia menor por colonización crónica de P.eruginosa, en la edad de aparición de diabetes o en la obstrucción de intestino en neonatos.

Terapias

La estrategia a seguir es clara, ¿verdad? Consiste en aumentar el transporte de iones cloruro a través de membrana celular epitelial con pequeñas moléculas. Pero claro, es difícil alcanzar las concentraciones necesarias de éstas in-vivo para que sean eficientes y, debido a ello, los más visionarios ya empiezan a trabajar en el reemplazo genético de la variante patogénica. Pese a todo, los tratamientos actuales han conseguido alargar la vida y mejorar la calidad de la misma. El primero en salir fue ivacaftor que llegó a fase clínica III recuperando hasta un 10% de función de CFTR con mutación G551D vs controles. Esto es considerado respuesta clínica efectiva. Para los pacientes con F508del se probó el compuesto lumacaftor, pero no era efectivo más que aumentando ligeramente la función.

Efectos sobre la función y cantidad de ivacaftor (G551D) y lumacaftor en F508del. El efecto sobre la función con lumacaftor no alcanzaba la respuesta clínica (área azulada)
Figura 3. Efectos sobre la función y cantidad de ivacaftor (G551D) y lumacaftor en F508del. El efecto sobre la función con lumacaftor no alcanzaba la respuesta clínica (área azulada).

Entendamos que la respuesta clínica requiere de función pero también de cantidad, y la cantidad de F508del era muy baja de partida, como muestra la Figura 3. Como solución se probó con la combinación de iva/lumacaftor, en estudios fase clínica III con respuestas modestas, pero mejoras en pulmón. Además, en caso de heterocigotos compuestos con F508del se ha visto la eficacia del tratamiento triple con elexa/teza/ivacaftor.

Lo habitual es trabajar con combinaciones de correctores (función; ivacaftor) y potenciadores (cantidad). El verdadero problema es la baja frecuencia de pacientes con cualquier otra mutación diferente a G551D o F508del,  que obstaculiza realizar estudios clínicos definitivos de la eficacia de fármacos. Por ello, la estrategia cambió a agrupar las variantes en teratipos (por cantidad de CFTR y función) y con ella, la FDA ha aprobado el uso de ivacaftor en hasta 8 variantes que afectan al “gating” de CFTR.

Finalmente, también existen defectos de procesado de RNA con codones prematuros de STOP causados, entre otros, por mutaciones de cambio de fase de lectura. En estos pacientes hay un decaimiento del mRNA por la respuesta NMD, y para inhibirla se han usado derivados de aminoglicósidos junto a ivacaftor como corrector (porque la proteína aún yendo a membrana no es nativa). Para defectos de splicing y grandes reordenamientos, no hay soluciones consistentes todavía.

Diagnóstico molecular

En primer lugar, no siempre mutaciones en CFTR se manifiestan con Fibrosis Quística, y es que existen desórdenes relacionados (CFTR-RD) como son la infertilidad, la pancreatitis idiopática o la rinosinusitis.

Las cuestiones emergentes que se plantea el diagnóstico molecular son: si una variante “X” debería ser reportada como patogénica, la relación genotipo-fenotipo y si una variante “X” debería ser o no considerada para el consejo genético.

Resumen de las pruebas realizadas para cada situación
Figura 4. Resumen de las pruebas realizadas para cada situación

El diagnostico se realiza en pacientes con síntomas típicos de FQ, personas con historial familiar o en un screening de recién nacidos (NBS). Se miden, en primer lugar, niveles de cloruro en sudor para, posteriormente, realizar la identificación molecular de 2 alelos patogénicos. Lo más usual es empezar con un kit que detecte las mutaciones más frecuentes en la región de que se trate y, si es negativo, se buscan las variantes raras, bien por secuenciación Sanger o bien por NGS (región codificante, intrones y parte del promotor).

Si los métodos moleculares anteriores dan negativo (en muy raros casos) se buscan en intrón profundo las que puedan afectar al mRNA, bien por estudios de células epiteliales nasales, bien por NGS de todo el locus. Y si todo esto fallase (actualmente no se realiza casi nunca), entonces habría que buscar elementos regulatorios y variantes estructurales resecuenciando mayor región genómica.

El diagnóstico molecular prenatal/preimplantacional (PGD) en descendencia se puede hacer incluso no invasivo en parejas portadoras (uno o ambos) buscando variantes en sangre periférica de la madre cuando el progenitor es portador, aunque se prevé cercano el NGS con determinación de haplotipo. Y si no hubiese historial familiar de FQ, el DM se realiza igualmente en caso de anormalidades ultrasónicas en sistema digestivo del feto.

Es de máxima importancia discernir cuando una variante rara es patogénica de FQ, ya que solo estas serían consideradas para interrupción del embarazo tras screening de los padres y PGD.

Variantes de la fibrosis quística y consejo genético

Cuando una mutación rara aparece, la colaboración entre clínicos, electrofisiólogos, genetistas moleculares e investigadores resulta esencial para la toma de decisiones. La piedra angular de todo este entramado es la existencia de bases de datos sobre variantes.

Hace dos décadas que apareció la primera de ellas, con 23 variantes (ACMG23) con el objetivo de diagnosticar y hacer screening de portadores y NBS. En 2010 apareció el proyecto CFTR2 con datos clínicos y genotipos de 40.000 pacientes en EE.UU. y Europa. Esto supuso la inclusión de 127 variantes con el consiguiente incremento de sensibilidad del 85% al 95%, pero, aun así, solo era representativa de blancos caucásicos. Por otro lado, CFTR-France está dedicada a la anotación de variantes raras y adopta datos tanto de FQ, de CFTR-RD y de individuos asintomáticos heterocigotos compuestos. La anotación entre ambas bases de datos no coincide siempre, pudiendo ser una mutación patogénica en una, pero no en la otra, lo que crea confusión a la hora del diagnóstico y del consejo.

Por si todo lo anterior no fuese complejo, los estudios de segregación alélica han desempolvado los denominados alelos complejos: las 2 variantes necesarias para enfermedad (recesividad) pueden heredarse de un solo progenitor (en cis). Mirar a los padres no es nimio, y es que se han encontrado hasta mutaciones de novo.

La pregunta que subyace a todo esto es: ¿cómo saber si una variante rara es patogénica? Pues os adelanto que no tiene respuesta fácil. Tradicionalmente, mirando población sana y determinando frecuencias alélicas. Si es muy común, no será patogénica. Y además, todas aquellas en trans con una patogénica, se determinan definitivamente como benignas. Pero esto no es válido en la fibrosis quística, donde la penetrancia es incompleta y donde la frecuencia alélica varía por grupos étnicos. Las evidencias de baja penetrancia son abrumadoras: variantes que son patogénicas en CFTR2 pero débiles en CFTR-France, una mayor frecuencia de variantes en población general que en pacientes o, lo más obvio, un estudio francés (2002-2017) demostró penetrancia incompleta en 10 variantes, entre ellas T5.

Con todo lo anterior, el reto para el consejo genético es aplastante: os animo a leer y recapacitar sobre el capítulo 4 de este maravilloso review (Bienvenu et al. 2020), sobre todo, en cuanto se refiere a la incorporación del NGS o de paneles dirigidos para el screening de portadores y NBS. La ACOG desaconseja la secuenciación NGS para el screening, y por su parte, la ACMG recomienda, como mínimo, 23 variantes, pero no es suficiente porque algunas de esas variantes son muy bajas en ciertos grupos étnicos (por ejemplo, asiático-americanos). Las guías europeas van más allá y dicen que toda variante con frecuencia superior a 0.5-1% debería ser incluida.

Por tanto, los actuales paneles NGS pueden no ser siempre la mejor solución, y de hecho, existen ya kits muy sensibles basados en otras tecnologías, como la de Luminex. Pero no solo eso, el estudio de (Beauchamp et al. 2019) tuvo en cuenta recientemente a múltiples grupos étnicos, y esto podría llevar a nuevos kits cuya sensibilidad sea mayor en ciertas poblaciones.

La base CFTR2 tiene menos en cuenta a poblaciones no caucásicas (5%) que la base generada por el estudio Beauchamp (44%)
Figura 5. La base CFTR2 tiene menos en cuenta a poblaciones no caucásicas (5%) que la base generada por el estudio Beauchamp (44%).

La empresa Asuragen se ha hecho eco de este estudio y ha desarrollado un kit donde lo que manda no es el máximo número de variantes (y aun así interroga 67 variantes patogénicas), sino lo representativas que son en población multiétnica, dicho de otro modo, lo importante no es la cantidad, si no la sensibilidad. Parece pues una opción prometedora para ciertas poblaciones multiétnicas, junto al NGS y kits existentes basados en la base CFTR2, ofreciendo  resultados fiables en tan solo 5 horas.
(White paper del kit de Asuragen).