CRISPR cas9 es la principal herramienta de edición genética en investigación médica aplicada y ensayos clínicos. Con sus solo 5 años de existencia ha conseguido revolucionar el campo y también evolucionar a través de un sinfín de mejoras de sus 2 componentes: la proteína cas9 y el sgRNA.

En este blog os contamos cómo funciona, su evolución y los retos que afronta de cara a la cura de enfermedades genéticas como el cáncer. Finalmente nos preguntamos: ¿podrá sobrevivir al descubrimiento de nuevas técnicas de edición mejoradas como la recientemente descubierta “Prime Editing”?

¿Cómo se descubrió?

CRISPR es el acrónimo inglés que designa a las secuencias de ADN palindrómicas cortas y regularmente espaciadas que encontró el español Francis Mojica en 2007 en bacterias.

Cinco años después descubrió que eran fragmentos de DNA de virus que atacan a bacterias (denominados bacteriófagos) y que las bacterias reconocían el DNA del virus de modo específico, lo cortaban para eliminar al virus (mediante la endonucleasa cas9) y además lo incorporaban a su genoma en forma de CRISPRs para defenderse de futuros ataques.

Sí, espectacular, un sistema inmune bacteriano en toda regla. De hecho, en 2013 se adaptó su uso para poder introducir inserciones o delecciones (indels) y mutaciones puntuales en el genoma de cualquier especie.

¿Cómo funciona?

La proteína cas9 reconoce el DNA diana gracias a:

  1. Una secuencia PAM (trinucleótido que varía según la cas9 utilizada) localizada 3-4 nucleótidos alejada del punto de corte.
  2. Un sgRNA que interacciona con cas9 y que la guía a la secuencia específica por complementariedad de secuencia.

Edición genética mediante CRISPR cas9

Tras ello se produce el corte de doble hebra dando lugar a dos vías posibles de reparación celular del DNA: la NHEJ, tendente a error y que produce indels (útil cuando se quiere eliminar un gen o “knock-out”) y la HDR, más precisa, en la que si además usamos un ADN donor podemos conseguir introducir secuencias (“knock-in”).

La posibilidad de crear un sgRNA complementario a la secuencia diana de interés nos permite teóricamente editar cualquier secuencia. Esto supone una clara ventaja frente a herramientas tradicionales como ZFN o TALENs, ambos haciendo uso de proteínas de unión a motivos de ADN pero sin la especificidad proporcionada por el sgRNA.

Posibles usos y variaciones del sistema CRISPR cas9

La tecnología CRISPR Cas9 puede ser usada para eliminar genes (knock-out) a través de indels que generen un cambio en la fase de lectura, dando lugar a codones de parada prematuros. Para asegurar la eliminación se tiende a usar 2 sgRNA, preferentemente dirigidos a algún dominio funcional existente en los primeros exones del gen.

Si por el contrario queremos introducir una secuencia o mutar la existente (knock-in) será necesario añadir un DNA donor que porta la secuencia a introducir. Generalmente la eficiencia (porcentaje de moléculas editadas) es baja y la presencia de subproductos indels es habitual (el mecanismo de reparación celular no es, ni mucho menos, exacto).

La ingeniería genética ha permitido eliminar la actividad endonucleasa de CRISPR cas9, llamándose ahora dCas9, y unir activadores o represores transcripcionales para regular, no eliminar, un gen. Se denominan respectivamente CRIPSRa y CRISPRi.

CRISPRi puede ser útil para genes letales donde la eliminación total por knock-out no es viable (aproximadamente un 30% del total de genes existentes). ¿Entonces por qué utilizar iCRISPR cas9 para inhibición pudiendo usar el tradicional iRNA? Por una sencilla razón, es mucho más específico y efectivo.

Uno de los principales obstáculos a que se enfrenta CRISPR cas9 es la modificación indeseada de otras secuencias en el genoma diana (off-targets). Un modo de intentar evitarlo es mediante la doble nickasa: sistema donde dos moléculas de proteína cas9 modificada para cortar una sola hebra (nickasa) se unen a ambas hebras mediante dos sgRNA complementarios, haciendo mucho más difícil que ambas encuentren otras dianas en otro locus.

Finalmente, con cualquiera de estos sistemas es posible hacer screening con librerías de sgRNA mediante selección positiva o negativa. ¿Os interesa ver qué genes o rutas pueden verse afectados por un nuevo fármaco? No tenéis más que transfectar con una librería que contiene miles y miles de sgRNA sobre un pool de células y posteriormente hacer la selección y subclonaje en presencia del fármaco. Así de sencillo (bueno vale, y complicado a la vez, tenéis razón).


Técnicas actuales que hacen uso de la tecnología CRISPR

Los 3 pasos a seguir: diseño, edición y análisis

El diseño del sgRNA se hace mediante programas bioinformáticos que analizan bases de datos genómicos para evitar fenómenos off-target indeseados. La síntesis de novo ha reemplazado a la transcripción in vitro por ser más precisa, sin mutaciones y por la posibilidad de añadir grupos protectores frente a ribonucleasas, aumentando la vida útil del sgRNA dentro de la célula.

En cuanto a la proteína Cas9 existen múltiples opciones, desde la tradicional Cas9 de S.pyogenes (spCas9) a la de S.aureus pasando por la nickasa ya comentada, que tienen diferentes tamaños y secuencias PAM a reconocer, lo que da una flexibilidad relativa.

Y en cuanto a la edición, ¿cuál pensáis que es el mejor método para modificar vuestros genes con CRISPR cas9?

Los expertos parecen coincidir en que utilizar ribonucleoproteínas de sgRNA + Cas9 (RNPs) es lo mejor. Y es que el uso de plásmidos de ADN produce dos efectos adversos:

  1. La proteína se expresa durante demasiado tiempo en la célula diana, por lo que la probabilidad de off-targets aumenta.
  2. La introducción aleatoria de secuencias intrínsecas del plásmido en el genoma puede producir citotoxicidad, como poco.

Para introducir nuestro CRISPR cas9 existen, a su vez, infinidad de combinaciones, desde la clásica transfección con liposomas a la utilización de adenovirus, partículas adenoasociadas (AAV), lentivirus o retrovirus. Las partículas virales son muy eficientes, pero, ¿adivináis el contrapunto? A mayor eficiencia de introducción de nuestros componentes ARN y proteína, mayor probabilidad de fenómenos no deseados off-target.

Tras la introducción de la maquinaria de edición, llega el paso más laborioso: el análisis. Aquí los criterios dependen de la profundidad deseada, que no siempre está en comunión con el presupuesto disponible. Lo mejor: secuenciar el pool de células modificadas, sea por Sanger o por secuenciación masiva (NGS) con el posterior y tedioso análisis bioinformático.

El NGS nos dirá la frecuencia de edición para calcular cuántos clones debemos analizar hasta tener lo deseado, pero además y de modo importante, si tenemos fenómenos off-target (esto se hace esencial cuando CRISPR cas9 se utiliza con fines médicos).

Aplicación en modelos animales y humanos. Ensayos clínicos.

La técnica CRISPR cas9 ha conseguido ya curar enfermedades genéticas en modelos animales . Entre ellas se cuentan la Distrofia Miotónica de Duchenne (DMD), la anemia falciforme (SCD), la b-talasemia o la tirosinemia tipo 1 (HT1).

Los estudios han estado siempre orientados a asegurar la eficacia y seguridad a largo plazo, incluso se han usado grandes animales como perros con DMD. Junto con ello, se han aliviado también síntomas en modelos animales de diabetes tipo 1, ELA (con mutaciones SOD-1) y pérdida genética de audición.

A pesar de los retos éticos y regulatorios, CRISPR cas9 se ha usado ya para rectificar mutaciones patogénicas en embriones humanos con síndrome de Marfan (mutaciones FBN1) o con b-talasemia (HBB-28). De manera más eficiente y sin fenómenos off-target se han conseguido rectificar mutaciones en MYBPC3 asociadas a cardiomiopatía hipertrófica.

Pero donde se ha ganado fama es en el campo de la inmunoterapia y la creación de células CAR-T. Podéis ver más información en otra entrada de nuestro Blog sobre terapia CAR-Ty en el siguiente artículo. CRISPR cas9 se utiliza para:

  1. Creación de los propios receptores quiméricos CAR.
  2. Insertar de modo selectivo en el genoma diana los receptores CAR bajo el control de un promotor endógeno, como el de TRAC, con el objetivo de conseguir regulación endógena, evitar la inserción descontrolada en otras regiones y reducir el fenómeno de apagado de las células T. Por ejemplo se ha utilizado para CD-19 – CAR-T en el tratamiento en ratón de leucemia linfoblástica aguda (ALL).
  3. Identificar nuevas dianas específicas de tumores mediante screening de librerías CRISPR cas9.
  4. Eliminar moléculas como el receptor de células T y el HLA clase I para evitar reacciones indeseadas receptor vs donante (“graft vs host”) en trasplante alogénico, que se posiciona como referente frente a la transferencia autóloga de células CAR-T modificadas. Esta última no siempre es posible por insuficiente contaje de linfocitos T citotóxicos y porque es más viable a nivel hospitalario mantener un pool alogénico para múltiples pacientes.
  5. Eliminar una de las moléculas check-point como PD1, CLA-4 o TIM3, o en combinación (múltiple knock-out) que impiden el ataque efectivo de las células CAR-T a las células transformadas (linfocitos B) o tumor sólido una vez introducidas en el paciente. Otras estrategias farmacológicas usando anticuerpos contra PD1 o PD-L1 han resultado en fuertes respuestas inmuno-inflamatorias.

Interacción entre células CAR-T y células de tumor

Los ensayos clínicos que usan CRISPR cas9 son abundantes, pero todavía no se dispone de resultados definitivos (Advancements and Obstacles of CRISPR-Cas9 Technology in Translational Research). Como ejemplos: el Knock-out de PD-1 en células T en pacientes de cáncer de pulmón y cáncer esofágico. Para cáncer de vejiga, próstata y de riñón se han aprobado pero todavía no se han reclutado pacientes.

El knock-out de PD-1, TCR en células antimesotelina – CAR-T se analiza en tumores sólidos positivos para mesotelina. Algunos ensayos analizan la eliminación de moléculas en superficie de células CAR-T para la mayor citotoxicidad, especificidad contra tumor y reducir inmunogenicidad, en cánceres de células B y T.

Además de modificar células inmunes para el tratamiento del cáncer (inmunoterapia), CRISPR cas9 puede ser usado para eliminar secuencias víricas en el virus del papiloma humano (causante entre otros de cáncer de cérvix). Un ensayo clínico aborda este campo con la administración de una crema que incluye el CRISPR- cas9 con secuencias HPV E6/E7.  La talasemia y la anemia falciforme son otras enfermedades que podrían ser curadas y que tienen también sus ensayos clínicos en marcha.

Prime Editing y la solución parcial a los problemas que plantea CRISPR

Como habéis visto a lo largo de este blog, un impedimento para el uso de CRISPR es la creación de modificaciones no deseadas “off-target”. ¿Pensáis que es el único problema? No, no lo es, hay alguno más como Alteraciones (delecciones y reordenamientos) en zonas próximas, pero también distales, polimorfismos específicos de cada sistema o paciente que hacen que el sgRNA sea ineficiente e inespecífico y la desregulación de la proteína supresora de tumores p53 que debería parar el ciclo celular cuando se produce un DSB, pero no lo hace, con lo que nos hace pensar en un posible fenómeno de crecimiento descontrolado a largo término, inaceptable en su uso con pacientes.

Pero no solo eso: ¿Recordáis que la proteína cas9 tiene origen bacteriano? Este origen hace que tengamos células T y anticuerpos presentes que produzcan rechazo de cas9, y además, menor eficiencia en la edición. Finalmente, las secuencias PAM no siempre están en nuestro gen diana y el HDR no es muy efectivo, por lo que el knock-in suele ser difícil de conseguir.

Parte de los problemas asociados a la tecnología CRISPR cas9 podrían haber visto su fin con la reciente aparición de la técnica denominada Prime Editing. Y es que algo se cuece cuando la revista de alto impacto Nature publica de un modo acelerado su artículo.

El grupo liderado por David R.Liu en Cambridge, EEUU, ha ideado de manera muy ingeniosa un método de edición que no necesita la generación de roturas de doble cadena (DSB), causantes de mezclas de productos génicos no deseados, como indels y traslocaciones y la activación de p53. Además no necesita un DNA donor para los knock-in y es eficiente para un elevado número de tipos celulares.

Os preguntaréis en qué consiste y si es muy diferente de CRISPR cas9. Pues en realidad no lo es, porque utiliza también una proteína cas9 de corte único, pero fusionada por ingeniería a una retrotranscriptasa de ratón (la archiconocida MMLV). Este sistema, denominado PE (prime editor) utiliza una única molécula pegRNA que:

  1. Guía a cas9 al punto de edición.
  2. Inicia la síntesis de hebra complementaria de RNA desde el punto de corte.
  3. Introduce la mutación deseada.

El producto final es una molécula de DNA heteroduplex que será reparada por la célula para restablecer la secuencia que deseemos.

Prime Editing
Figura 4: Edición genética mediante Prime Editing con pegRNA y Prime Editor (PE)

De modo impactante los autores han hecho y desecho todo tipo de mutaciones puntuales, inserciones, delecciones, que suponen el nada despreciable porcentaje del 90% de mutaciones patogénicas humanas. Y demuestran que los indels no deseados se reducen, los off-target se hacen casi indetectables y que células que no se podían modificar ahora son editables, incluidas células primarias de cerebro. Por si todo esto no fuera poco, los valores de eficiencia mejoran, con el consiguiente ahorro de tiempo y coste.

La brecha está abierta. ¿Conseguirá CRISPR cas9 sobrevivir al cambio o habrá un movimiento masivo hacia el Prime Editing? Los ensayos clínicos en marcha tienen la palabra, ciertamente, pero no son lo único a tener en cuenta cuando está en juego la seguridad y eficacia en tratamientos humanos, factores que motivan su existencia.

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