La Distrofia Miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad genética autosómica dominante con una incidencia media de uno de cada 8.000 nacimientos. A pesar de ser una patología altamente discapacitante, incluso mortal, no existen tratamientos aprobados para curarla.

Se han realizado un gran número de investigaciones para la búsqueda de moléculas que consigan aliviar sus síntomas, entre los que destacan la debilidad muscular, atrofia muscular y miotonía. Sin embargo, los estudios se han realizado fundamentalmente en modelos celulares y animales y muy pocos fármacos han sido aprobados para ensayos clínicos en humanos.

El éxito en el descubrimiento del primer fármaco efectivo y seguro requerirá de un gran conocimiento de las bases celulares y moleculares de la enfermedad, como el que atesoran unos científicos valencianos y que recientemente ha atraído la atención de múltiples medios de comunicación.

Bases genéticas y moleculares de la distrofia miotónica

La forma más frecuente de distrofia miotónica conocida como tipo 1 o DM1 se produce por la expansión de más de 50 copias del  trinucleótido CUG en el  extremo no codificante 3’ UTR del RNA mensajero (mRNA) codificado por el gen dmpk. Esto conduce a la formación de estructuras de RNA secundarias llamadas horquillas que secuestran proteínas celulares, privándolas de su sitio original donde se encuentran en condiciones fisiológicas.

Una de estas proteínas es la familia “muscleblind” o MBNL que en condiciones normales es un actor principal en el “corta y pega alternativo” (o splicing alternativo) mediante el cual los intrones se eliminan y se juntan los exones de modos “alternativos”. En esta familia destaca MBNL1 que actúa en músculo esquelético y MBNL2 en cerebro.

¿Pero qué hacen estas proteínas? Pues ejercen de interruptor que apaga el splicing alternativo fetal propio de algunos genes y activan el de adulto, produciéndose diferentes proteínas respectivamente. Es por ello que en pacientes con distrofia miotónica este “splicing” normalmente no se produce (quedarían estas proteínas por así decirlo en un estado fetal que es tóxico en adulto).

Como consecuencia, diversos genes dan lugar a proteínas anómalas, cada cual explicando algunos fenotipos observados en DM1: INSR produce resistencia a insulina, CLCN1 produce miotonia, BIN1 y DMD dan lugar a debilidad muscular y SCN5A a conductividad alterada en miocardio. Por otro lado, hay proteínas como CELF1, implicada también en el splicing, que se activan por mecanismos independientes de la unión a las horquillas CUG.

Modelos experimentales de la enfermedad

Es esencial disponer de modelos que permitan testar de un modo eficaz los diferentes tratamientos como paso previo al ensayo clínico en humanos. El modelo más próximo a una situación patológica real son los mioblastos aislados de paciente con distrofia miotónica, seguido de fibroblastos de paciente diferenciados a mioblastos.

Los estudios previos han usado también modelos animales. Se dispone de ratones modificados genéticamente con repeticiones CUG dentro del gen de actina esquelética (ratón HSA) o bien modificados con el gen entero humano DM1, con 500 o 1000 repeticiones CTG (ratón DM500 o DM500XL, respectivamente). La mosca de la fruta (D.melanogaster) expresando repeticiones CUG también se usa ya que permite ver fácilmente la degeneración de ojo y muscular del ala.

Estrategias de tratamiento y posibles fármacos

Me imagino que os estaréis preguntando qué se considera una buena estrategia de tratamiento. Una buena estrategia sería aquella que ataje el problema de raíz, de modo específico y sin fenómenos “off-target”, porque cuanto más alejada del origen del problema se diseñe una molécula mayor será la probabilidad de tocar algo que no debemos.  Por tanto, y en principio, lo mejor es trabajar sobre la interacción de la horquilla CUG de dmpk y proteínas que se unen.

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Figura 1: Tratamientos para la distrofia miotónica tipo I con diana en el gen dmpk: las proteínas MBNL son liberadas del mRNA  por cualquiera de los métodos descritos en los puntos a) a c)

Se han utilizado los siguientes compuestos y moléculas (Artículo ScienceDirect):

  • a) iRNA (RNA de interferencia) en sus diferentes formas (siRNA o miRNA). Sabemos que los iRNA se unen a un mRNA por complementaridad de secuencia y gracias a las endonuleasas Argonaute (AGO) y el complejo RISC el mRNA es eliminado. El problema es que se degradan muy fácilmente antes de llegar a su diana, por lo que se han utilizado vectores virales, sin mucho éxito.
  • b) Otra molécula de rabiosa actualidad son los ASO (Oligos anti-sense). Estos atraviesan la membrana y se unen finalmente al mRNA diana, pero por un mecanismo diferente al de los siRNA. Los ASO pueden modificarse químicamente y mejorarse. Esta estrategia ha tenido gran éxito en otras enfermedades con la aprobación de Eterplisen para DMD (Distrofia miotónica de Duchenne) y Spinraza para AME (Atrofia Muscular Espinal).

Los ASO probados en modelos de Distrofia miotónica tipo I se dividen en dos tipos:

b1)  Los bloqueantes de RNA donde el ASO se une a la región 3’ UTR con repetición CUG de dmpk e impide la unión, o mejor dicho, desplaza, a las proteínas muscleblind MBNL, por lo que ya estarían disponibles para su función habitual de splicing sobre otros mensajeros.

b2)  Los cortadores de RNA, que buscan degradar la molécula de mRNA de dmpk por la ruta de la RNasa H. Y sí, aunque pueda parecer sorprendente los fenotipos anormales desaparecieron en los estudios, sin que la desaparición del mRNA de dmpk sea deletérea a simple vista. Precisamente el fármaco ISIS486178 es de los pocos que han sido usados en pacientes DM1, pero con resultados variables entre pacientes y sin alcanzar la dosis esperada en músculo.

  • c) También se ha utilizado la tecnología iCRISPR con CRISPR-Cas9 en su variante de dcas9 (endonucleasa desactivada) con la endonucleasa PIN en conjunción con un sgRNA que guía al gen dmpk la maquinaria CRISPR-dcas9-PIN.
  • d) Moléculas químicas que, o bien reducen la expresión de dmpk o bien inhiben la maquinaria de metilación del gen MBNL1 impidiendo la compactación de cromatina y como consecuencia aumentando los niveles disponibles de esta proteína. También se ha intentado reducir la forforilación de CELF1, directa o indirectamente.  En este último grupo se incluye el fármaco Tideglusib, que ha sido probado en ensayos clínicos fase II en personas para inhibir la proteín kinasa GSK3.
  • e) Finalmente, compuestos naturales como el resveratrol consiguió mejorar en un ensayo clínico el splicing de INSR (receptor de insulina) y la vitamina B1 hizo recuperar fuerza muscular e independencia en el día a día de pacientes con DM1. Incluso el antibiótico eritromicina recuperaba el splicing y redujo la miotonía. Aunque no se conocen las bases moleculares precisas de la recuperación parcial, la reformulación de estos compuestos permite trabajar sobre datos clínicos ya conocidos y valores de farmacocinética que permitirían acelerar la evolución en ensayos clínicos.

El proyecto Arthex- 01

La compañía Arthex ubicada en Paterna, Valencia, surge como una spin-off de la Universidad de Valencia. Contando con una ronda semilla de inversión de €1.5 millones  y el apoyo de grandes investigadores tienen un objetivo claro: desarrollar un fármaco que podría suponer un gran salto en la cura de la distrofia miotónica tipo 1.  

Su estrategia es simplemente brillante (Artículo de la revista Nature sobre las proteínas MBNL1 y MBNL2). Han descubierto que la expresión de las proteínas MBNL1 y MBNL2 es inhibida parcialmente en condiciones fisiológicas por dos miRNA: miR-23b y miR-218. Han desarrollado unas moléculas llamadas antagomiRs (ver figura 2) que por complementaridad de secuencia reconocen y se unen a los miRNA. Los AntagomiR (denominados también antimiR) son ASO con una porción de colesterol que les permite atravesar la membrana celular.

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Figura 2: Mecanismo de silenciamiento génico mediante inhibición con miRNAs endógenos. Este mecanismo celular es inhibido por el uso de antagomiRs.

Si inhibes o eliminas al inhibidor, ¿qué pensáis que puede ocurrir? Exacto, que las proteínas MBNL se expresan en más cantidad, por lo que aunque una parte se una a las repeticiones CUG de dmpk habrá cantidad suficiente para ir a otros sitios donde muscleblind es necesaria (han comprobado previamente que un aumento de expresión de MBNL no es deletéreo para las células).

El primer paso ya lo tienen hecho: han comprobado la recuperación de splicing normal, la mejora de la histopatología y recuperación de miotonía y fuerza muscular en diferentes modelos de distrofia miotónica, incluyendo mioblastos y ratón. Y han comprobado que los efectos secundarios del tratamiento en ratón son mínimos con tan solo un ligero aumento de bilirrubina y de monocitos.

Parece prometedor, ¿verdad? Así y todo, se enfrentan a retos como la posible activación inmunitaria. Además no han conseguido arreglar los problemas de splicing debidos a la activación de CELF-1.

Diagnóstico de la Distrofia Miotónica

Debido a la enorme longitud de las repeticiones y el alto contenido en C+G los métodos clásicos basados en PCR no funcionan.

El método de referencia para el diagnóstico genético de la distrofia miotónica ha sido durante mucho tiempo el Southern blot, técnica altamente compleja que requiere una semana para completarse, necesitándose una gran cantidad de partida de DNA así como en algunos casos de ciertas técnicas radiactivas difíciles de implementar en los hospitales. Además, la técnica no permite en muchos casos determinar con suficiente precisión el número de copias del triplete CTG.

La alternativa al método anterior  se basa en la combinación efectiva de la PCR, eso sí, optimizada para fragmentos muy largos y de alto contenido en C+G, junto con el análisis de fragmentos, para de este modo lograr el diagnóstico de manera sensible, precisa y rápida.

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