comercial RAFER S.L. - Síndrome X Frágil

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Síndrome X Frágil

Amplidex™ FMR1 PCR Reagents (CE-IVD)

Alteración del gen FMR1

El Síndrome X Frágil (FXS) o de Martin-Bell se caracteriza por la expansión del triplete de nucleótidos CGG en la región 5’UTR del gen FMR1 (Fragil X Mental Retardation 1), situado en la región Xq27.3 del cromosoma X. Este trastorno es la forma más común de retraso mental hereditario, afectando a uno de cada 4000 varones y a una de cada 8000 mujeres de un amplio rango de edad. Se considera también la causa genética más frecuente de autismo.

Los individuos con alelos normales (entre 5 y 44 repeticiones de CGG) o intermedios (entre 45 y 54 repeticiones) no presentan ninguna sintomatología. Los individuos con alelos en estado de premutación (de 55 a 200 repeticiones) pueden desarrollar dos enfermedades asociadas a X frágil; Síndrome con temblor/ataxia (FXTAS) e Insuficiencia ovárica primaria (FXPOI), mientras que aquellos con mutación completa (más de 200 repeticiones) sufren el cuadro clásico de X Frágil. En este último caso se produce la hipermetilación de la isla CpG adyacente al gen FMR1 y como consecuencia la inactivación del mismo. La inhibición de la transcripción de la proteína codificada por el gen (FMRP) es la causante de las manifestaciones clínicas de la enfermedad.

Debido a esta correlación entre el patrón molecular del gen y las distintas situaciones clínicas el estudio de la zona repetitiva (CGG)n y del grado de metilación en FMR1 resulta muy útil para determinar la herencia de la enfermedad dentro de una familia y para establecer un diagnóstico de todas las clases de individuos relacionados con el cromosoma X frágil.

Tecnología PCR y electroforesis capilar para el análisis molecular del gen FMR1

El sistema Amplidex™ FMR1 PCR Reagents de Asuragen permite la detección y cuantificación del número de repeticiones CGG en el gen FMR1. Las principales innovaciones del producto se basan en la combinación óptima de primers específicos del gen, un buffer de amplificación para secuencias ricas en GC y condiciones optimizadas para la reacción de PCR.

Constituye una alternativa eficaz a las limitaciones de los métodos actuales de diagnóstico, Southern blotting y PCR.

Características	Amplidex™ FMR1 PCR	PCR convencional	Southern blotting
Duración y manejo de la técnica	Horas. Fácil de usar	Horas. Fácil de usar	Días. Técnica laboriosa
Muestra requerida	2 uL gDNA(10-40 ng/µL	2 uL gDNA(10-40 ng/µL	5-10 µg gDNA
Determinación de repeticiones CGG	• Determinación del número exacto. • Amplificación optimizada de alelos con más de 1000 CGG	• Determinación del número exacto. • Amplificación optimizada hasta 300-500 CGG. • Dificultad de amplificar secuencias grandes y ricas en GC	• Determinación imprecisa del número. • Detección de fragmentos con más de 1000 CGG
Sensibilidad	• Más sensible que Southern para detectar alelos poco abundantes en mosaico. • Diferenciación precisa entre mujeres heterocigotas y homocigotas	• Poco sensible para detectar alelos en mosaico. • Amplificación preferente del alelo más pequeño en mujeres heterocigotas	Poco sensible para detectar alelos en mosaico y mujeres heterocigotas
Información sobre el estado de metilación	Determinación exacta del % de metilación	No proporciona datos sobre la metilación	Estimación del % de metilación

Los productos de PCR son analizados mediante electroforesis capilar (Genetic Analyzers, polímero POP-7, capilar de 36 o 50 cm), técnica de alta resolución que permite la cuantificación precisa de las repeticiones CGG y la detección de alelos con una repetición CGG de diferencia.

Tres formatos disponibles:

• Gene-especific FMR1 PCR: combinación optimizada de primers específicos del gen FMR1 para determinar de forma exacta el tamaño del alelo

Alta sensibilidad para distinguir alelos con 1 CGG de diferencia

Alta precisión para determinar el número de repeticiones CGG

• CGG Repeat Primed (RP) FMR1 PCR: permite una cuantificación más precisa de los tripletes CGG, resuelve problemas de diferenciación entre mujeres heterocigotas y homocigotas e identifica elementos espaciadores AGG entre las secuencias de repeticiones CGG.

Conocimiento de la estructura interna de la región de repeticiones CGG

• FMR1 Methylation PCR: mediante endonucleasas y primers marcados determina el estado de metilación alelo-específico, revelando nuevos patrones de metilación no observables con Southern blotting.

La combinación de los tres formatos ofrece un diagnóstico más completo: ayuda a determinar el riesgo de expansión de tripletes y a relacionar el genotipo con fenotipos emergentes relacionados con el gen FMR1 (FXS, FXTAS y FXPOI).

Gene-especific PCR

CGG Repeat Primed PCR

Methylation PCR

Componentes del kit Amplidex™ FMR1 PCR Reagents
• Human FMR1 F, R FAM-Primers
• FMR1 CGG Primer
• GC-Rich AMP Buffer
• GC-Rich Polymerase Mix
• Diluent
• ROX 1000 Size Ladder

Ventajas del kit Amplidex™ FMR1 PCR Reagents frente a otros métodos actuales que utilizan Repeat Primed FMR1 PCR
• Reactivos compatibles con una gran variedad de termocicladores y de equipos de electroforesis capilar.
• La determinación del tamaño de los alelos se realiza mediante 1 única reacción de PCR.
• Permite detectar toda la longitud de los alelos con mutación completa.
• Permite determinar más de 200 repeticiones CGG.
• Facilita la identificación de alelos en mosaico poco abundantes.
• La sensibilidad de detección de mutaciones completas en mosaico es del 1 %.
• Gracias a la pareja de primers específicos es posible genotipar el gen FMR1.